【Visium Spatial Gene Expression】必看常见Q&A

10x Genomics致力于探索复杂组织生物学的空间动态,并了解细胞微环境对正常发育和疾病病理学的影响。使用创新的Visium空间基因表达解决方案,让您无需预先选择靶标即可从完整的组织切片中提取总mRNA,并将该基因表达信息叠加到H&E染色组织的高分辨率图像上。
 
该解决方案除了结合传统的病理学方法,包括组织切片、H&E染色、显微镜成像,同时还整合了次世代定序技术。因此Visium空间基因表达解决方案将大大助于scRNA-seq实验和组织分析研究。
 
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Visium Spatial Gene Expression的常见问题:
 
  • 组织制备Tissue Preparation
Q1. 可以在Visium Spatial Gene Expression玻片上同时操作不同的组织类型吗?
可以,每片玻片包含四格Capture Area,因此一片玻片可以测试多达四种不同组织类型的组织切片,但不同组织的最佳通透时间需要以组织优化(Tissue Optimization)实验来确定。
 
Q2. 福马林固定石蜡包埋(FFPE)组织是否适用?
Visium Spatial Gene Expression目前适用OCT的新鲜冷冻组织,10x Genomics的研发团队正在积极开发FFPE样本的方法。
 
Q3. 组织可以进行IHC染色吗?
目前Visium空间基因表达实验步骤是使用H&E染色,而10x Genomics研发团队还在积极研究将IHC染色整合到实验步骤中。
 
Q4. 有最大的组织切片厚度限制吗?
Visium空间基因表达玻片的切片厚度取决于组织类型。例如,脂肪组织通常需要较厚的厚度。客户可以尝试以其组织类型的最小建议切片厚度获得高质量的切片。目前组织切片的厚度适用于5–35 µm,大多数组织类型落在10 µm。
 
 
  • 空间基因表达玻片Visium Spatial Gene Expression Slides 
在Visium空间基因表达玻片上具有四格Capture Area,每格Capture Area约有5000个Barcoded Spot,而一个Barcoded Spot包含数百万个具有空间条形码(Spatial Barcode)的oligo。实验过程先将组织贴在Capture Area上,在组织通透后组织mRNA会释放出来并与玻片上oligo结合,借此获得基因表达信息。
 
 
Q1. 一个Barcoded Spot可能捕获不止一种细胞类型的mRNA吗?
是的,这取决于组织类型、细胞大小以及细胞的密度,平均每个Barcoded Spot会复盖到1到10个细胞,这些细胞可能是或可能不是同一细胞类型。每个Spot的直径约为55 um,从一个Spot的中心到另一个Spot的中心的距离约为100 um。
 
Q2. 玻片内以及玻片间的变异性?
这没有标准答案,因为每个组织都是独特的,因此本身就具有一些先天的可变性。但是要维持同一玻片或玻片间的数据一致性,最有效的方法是透过组织品质控制,这需要熟练组织制备和冷冻切片。
 
研发团队从老鼠的大脑中获取了四个连续的组织切片,并将它们放在同一张玻片上。他们将相同的实验重复了六个星期,连续拍摄了四个部分,然后每周将它们放到一张新玻片上。他们比较了这些玻片的基因表达数据,发现R平方值为0.99,证实数据是具有高度相关性的。
 
Q3. 若一次未使用完所有玻片上的Capture Area,玻片是否可以重复使用?
Visium空间组织优化玻片(TO slide)或基因表达玻片(GE slide),无论在处理过程中是否使用了所有Capture Area,玻片都无法再做使用。这是因为实验包含了切片染色、漂洗和重新干燥的步骤,这些步骤会破坏未使用的Capture Area上的oligo,并降低其总体灵敏度。
 
Q4. 成像测试玻片(Imaging Test Slide)的目的?
Visium配件套组中提供的成像测试玻片有两个目的,一是确定客户的成像系统是否与Visium兼容;二是用于Visium组织优化和基因表达实验步骤中影像程序的建立。
 
有关更多详细信息,请阅读《Visium空间基因表达成像操作手册》
 
  • 分析空间基因表达数据Analyzing Spatial Gene Expression Data
Q1. 操作分析数据软体(Space Ranger、Loupe Browser)需要程序设计或生物资讯方面的经验吗?
通常需要有些生物资讯经验的人才能使用Space Ranger,因为Space Ranger需要在Linux机器上运行,所以需有命令操作以及如何登录和登出linux服务器的基本了解。但是档案和算法已包含在软体中,所以在大多数情况下Space Ranger是高度自动化的。因此,只需在测序后简单地将文件输入提供给Space Ranger,即可让软体生成空间基因表达数据。
 
另外,Loupe Browser具有完整的成像接口,完全不需要额外程序设计。但是如果客户要找寻特殊的空间基因表达数据,或者创建一个自定义的图形,这可能需要额外学习R或其他程序设计脚本的编程语言。
 
Q2. 可以使用Space Ranger和Loupe Browser分析旧版的Spatial Transcriptomics pipeline吗?
不能,数据类型完全不同所以无法兼容。
 
Q3. 是否有类似于Seurat的R的第三方工具来分析空间基因表达数据?
目前用于分析空间基因表达数据的第三方工具正在快速增加,其中包括SpanielGiotto以及Seurat。Space Ranger与Cell Ranger Feature Barcode的输出格式相同,所以可以将此输出直接输入到Seurat中进行进一步分析。
 
此外,10x Genomics为了帮助用户对样品进行深度分析而建立了R resources,让用户能够同时检视多个基因、样本和特征,例如基因、UMI和clusters。这功能在比较不同样本,例如wild type、diseased和treated样本会特别有用。
 
 
  • 网路研讨会的精采回顾
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  1. Visium空间基因表达解决方案入门
  2. 探索新领域-可视化Visium基因表达数据
 
Translated from the original:
 
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