【Visium Spatial Gene Expression】必看常見Q&A

10x Genomics致力於探索複雜組織生物學的空間動態,並了解細胞微環境對正常發育和疾病病理學的影響。使用創新的Visium空間基因表達解決方案,讓您無需預先選擇靶標即可從完整的組織切片中提取總mRNA,並將該基因表達信息疊加到H&E染色組織的高分辨率圖像上。
 
該解決方案除了結合傳統的病理學方法,包括組織切片、H&E染色、顯微鏡成像,同時還整合了次世代定序技術。因此Visium空間基因表達解決方案將大大助於scRNA-seq實驗和組織分析研究。
 
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Visium Spatial Gene Expression的常見問題:
 
  • 組織製備Tissue Preparation
Q1. 可以在Visium Spatial Gene Expression玻片上同時操作不同的組織類型嗎?
可以,每片玻片包含四格Capture Area,因此一片玻片可以測試多達四種不同組織類型的組織切片,但不同組織的最佳通透時間需要以組織優化(Tissue Optimization)實驗來確定。
 
Q2. 福馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織是否適用?
Visium Spatial Gene Expression目前適用OCT的新鮮冷凍組織,10x Genomics的研發團隊正在積極開發FFPE樣本的方法。
 
Q3. 組織可以進行IHC染色嗎?
目前Visium空間基因表達實驗步驟是使用H&E染色,而10x Genomics研發團隊還在積極研究將IHC染色整合到實驗步驟中。
 
Q4. 有最大的組織切片厚度限制嗎?
Visium空間基因表達玻片的切片厚度取決於組織類型。例如,脂肪組織通常需要較厚的厚度。客戶可以嘗試以其組織類型的最小建議切片厚度獲得高質量的切片。目前組織切片的厚度適用於5–35 µm,大多數組織類型落在10 µm。
 
 
  • 空間基因表達玻片Visium Spatial Gene Expression Slides 
在Visium空間基因表達玻片上具有四格Capture Area,每格Capture Area約有5000個Barcoded Spot,而一個Barcoded Spot包含數百萬個具有空間條形碼(Spatial Barcode)的oligo。實驗過程先將組織貼在Capture Area上,在組織通透後組織mRNA會釋放出來並與玻片上oligo結合,藉此獲得基因表達信息。
 
 
Q1. 一個Barcoded Spot可能捕獲不止一種細胞類型的mRNA嗎?
是的,這取決於組織類型、細胞大小以及細胞的密度,平均每個Barcoded Spot會覆蓋到1到10個細胞,這些細胞可能是或可能不是同一細胞類型。每個Spot的直徑約為55 um,從一個Spot的中心到另一個Spot的中心的距離約為100 um。
 
Q2. 玻片內以及玻片間的變異性?
這沒有標準答案,因為每個組織都是獨特的,因此本身就具有一些先天的可變性。但是要維持同一玻片或玻片間的數據一致性,最有效的方法是透過組織品質控制,這需要熟練組織製備和冷凍切片。
 
研發團隊從老鼠的大腦中獲取了四個連續的組織切片,並將它們放在同一張玻片上。他們將相同的實驗重複了六個星期,連續拍攝了四個部分,然後每週將它們放到一張新玻片上。他們比較了這些玻片的基因表達數據,發現R平方值為0.99,證實數據是具有高度相關性的。
 
Q3. 若一次未使用完所有玻片上的Capture Area,玻片是否可以重複使用?
Visium空間組織優化玻片(TO slide)或基因表達玻片(GE slide),無論在處理過程中是否使用了所有Capture Area,玻片都無法再做使用。這是因為實驗包含了切片染色、漂洗和重新乾燥的步驟,這些步驟會破壞未使用的Capture Area上的oligo,並降低其總體靈敏度。
 
Q4. 成像測試玻片(Imaging Test Slide)的目的?
Visium配件套組中提供的成像測試玻片有兩個目的,一是確定客戶的成像系統是否與Visium兼容;二是用於Visium組織優化和基因表達實驗步驟中影像程序的建立。
 
有關更多詳細信息,請閱讀《Visium空間基因表達成像操作手冊》
 
  • 分析空間基因表達數據Analyzing Spatial Gene Expression Data
Q1. 操作分析數據軟體(Space Ranger、Loupe Browser)需要程式設計或生物資訊方面的經驗嗎?
通常需要有些生物資訊經驗的人才能使用Space Ranger,因為Space Ranger需要在Linux機器上運行,所以需有命令操作以及如何登錄和登出linux伺服器的基本瞭解。但是檔案和算法已包含在軟體中,所以在大多數情況下Space Ranger是高度自動化的。因此,只需在測序後簡單地將文件輸入提供給Space Ranger,即可讓軟件生成空間基因表達數據。
 
另外,Loupe Browser具有完整的成像介面,完全不需要額外程式設計。但是如果客戶要找尋特殊的空間基因表達數據,或者創建一個自定義的圖形,這可能需要額外學習R或其他程式設計腳本的編程語言。
 
Q2. 可以使用Space Ranger和Loupe Browser分析舊版的Spatial Transcriptomics pipeline嗎?
不能,數據類型完全不同所以無法相容。
 
Q3. 是否有類似於Seurat的R的第三方工具來分析空間基因表達數據?
目前用於分析空間基因表達數據的第三方工具正在快速增加,其中包括SpanielGiotto以及Seurat。Space Ranger與Cell Ranger Feature Barcode的輸出格式相同,所以可以將此輸出直接輸入到Seurat中進行進一步分析。
 
此外,10x Genomics為了幫助用戶對樣品進行深度分析而建立了R resources,讓用戶能夠同時檢視多個基因、樣本和特徵,例如基因、UMI和clusters。這功能在比較不同樣本,例如wild type、diseased和treated樣本會特別有用。
 
 
  • 網絡研討會的精采回顧
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  1. Visium空間基因表達解決方案入門
  2. 探索新領域-可視化Visium基因表達數據
 
Translated from the original:
 
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