世基3101檢測套組技術操作上會遇到哪些問題?
世基3101檢測套組
常見問題
以下是在使用世基3101檢測套組的客戶曾經產生的疑問。倘若您無法在此找到解答,煩請與世基生物醫學技術支援部門聯繫,以取得相關資訊或解答您的疑問。
- 我應該如何保存世基3101檢測套組?
世基3101檢測套組應保存於-20°C。當使用時,應置於冰上解凍,並避免光線直射。 - 我能使用含有Heparin的採血管嗎?
因為Heparin會抑制PCR反應。我們建議您使用含有Sodium Citrate或EDTA為抗凝劑的採血管。 - 在萃取基因體DNA時,是否有建議使用的萃取套組?
我們建議您使用已通過世基公司檢測品質檢測之Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中的基因體DNA。 - DNA的品質要求為何?
為了維持良好的反應結果,我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。 - 我應該加入多少基因體DNA?
我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的Ct值過高的風險。 - 每個樣本需要多少反應數?
每一樣本需同時上兩個反應。一個是PG3101偵測反應,另一則是內部控制組偵測反應。 - 世基3101檢測套組中含有哪些螢光染劑?
主要含有螢光物質SYBR Green I。你可以在機器上選擇SYBR or FAM的螢光偵測(為相同的波長)。 - 在即時聚合酶連鎖反應的軟體設定上,我應該如何設定Quencher或Reference dye?
Quencher應被設定為無(None)。如果您使用的設備有需要設定Reference dye,請選擇Rox.。 - 我要如何設定機器分析的閥值呢?
依不同廠牌不同機型有不同的設定。請參考仿單上第4.4節的建議閥值設定。 - 我要如何區分檢體是否為陽性或陰性?
當內部控制組IC Ct ≤30且∆Ct ≤5時,即為陽性檢體。當IC Ct ≤30且∆Ct >5時,即為陰性檢體。 - 我是否需要對兩種不同的偵測組分別設定兩個不同的閥值呢?
只需要設定一組閥值即可,請參考仿單上第4.4節的建議的閥值設定。我們考量到使用上的方便性,特別設計了兩種相同斜率的擴增曲線,因此只需要設定一組閥值即可。 - 內部控制組一定會有訊號嗎?
內部控制組主要為偵測人類Housekeeping Gene的產物。因此,每一個檢體的內部控制組都會有訊號產生。同時,也藉由其來監測加入檢體的量及品質。 - PG3101偵測反應是否一定會有數值產生呢?
每一個檢體應有內部控制組的Ct值數據。至於PG3101基因偵測組Ct值數據則是在偵測到HLA-A*3101基因序列或相似序列的檢體時才會產生。 - 實驗樣本是否需要重覆檢測(Duplicate)呢?
依照仿單說明操作,樣本不需重覆檢測。但仍需依照各實驗室的內部品質控管要求調整。 - 為什麼有時候空白控制組會有Ct數值出現?
空白控制組是以不含核酸酶的水取代基因體DNA。當空白控制組出現Ct值時,表示人為污染出現在本次操作中,通常有可能是來自檢體的基因體DNA污染,或是來自陽性控制組的核酸分子的污染。 - 我要如何設定即時定量PCR的操作軟體呢?
世基生物醫學股有限公司提供幾種常用的即時定量PCR操作的說明書,請來信詢問或索取。 - 我要如何洽詢世基公司的技術支援部門呢?
請來電02-27985885詢問或寄信至service@pharmigene.com。
疑難排解
此疑難排解可能有助於解決您使用世基3101檢測套組時在技術操作或數據分析方面的疑難。倘若您無法在此找到排除疑難的方法,煩請與世基生物醫學技術支援部門聯繫,以取得技術 上的幫助。
問題 | 可能的原因 | 建議 | |
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a. | 沒有偵測到放大訊號 | 選錯了偵測波段(非SYBR/FAM) | 假使您使用的即時偵測定量系統會自動偵測全波段,你只需重新將偵測波段設定至(SYBR/FAM)並重新再計算即可。假使您的系統不能自動偵測全波段,必需重新執行此檢測。 |
缺少了某必要的成份 | -請確認您添加的反應成份。 -請重新執行檢測一次。 -建議每次檢測皆加入套組提供的陽性、空白控制組。 |
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執行程式設定有誤 | 請確認反應條件是否和仿單上的一致。 | ||
機器功能上的故障 | 請聯絡測試平台的維修廠商。 | ||
b. | 內部控制組的Ct值過高(IC>30) | 使用含有Heparin為抗凝劑的採血管 | -請使用含有sodium citrate或EDTA為抗凝劑的採血管。 -請在三天內完成基因體DNA萃取。 |
PCR過程中有抑制反應發生 | -進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。 -建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中的基因體DNA。 |
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加入不適當的基因體DNA總量 | 我們建議每一反應加入總量為25-100ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的Ct值過高的風險。 | ||
基因體DNA品質不良 | -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。 -進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。 -建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。 |
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過低的原濃度基因體DNA | 依據不同的萃取方法、血液的品質、保存的條件而有所影響,建議重新基因體DNA萃取以增加濃度並減少回溶的體積。 | ||
套組冷、解凍超過三次以上 | 建議可以先進行分裝,以減少冷、解凍的次數。 | ||
套組保存在不適的溫度 | -請置於-20度長期保存。 -使用時請將試劑置於冰上解凍。 |
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在過度光照下操作過久 | -儘可能將操作時間縮短。 -將配置的反應液避光處理。 |
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c. | 陰性控制組出現Ct數據 | 有污染發生 | -重新進行反應一次。 -請全程帶手套配置反應液。 |
d. | 檢體的∆Ct明顯高於陽性控制組的 | 檢體DNA品質不良 | -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。 -進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。 -建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。 |
取量不勻或少加了某成份 | 請確認可能少加了那些反應成份。 | ||
e. | Ct值有不穩的現象 | 取量不勻或少加了某成份 | 請確認可能少加了那些反應成份。 |
加入不適當的基因體DNA總量 | 我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的Ct值過高的風險。 | ||
基因體DNA品質不良 | -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。 -進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。 -建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。 |
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過低的原濃度基因體DNA | 依據不同的萃取方法、血液的品質、保存的條件而有所影響,建議重新基因體DNA萃取以增加濃度。 | ||
試劑沒有混合均勻 | 配置反應液前請均勻混合試劑。 | ||
有污染發生 | -重新進行反應一次。 -請全程帶手套配置反應液。 |
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加入不適當的基因體DNA總量 | 我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的訊號不穩定的風險。 | ||
反應液沒有在管底 | 請使用較高的離心速度將反應緩衝液離心到管底。 | ||
機器功能上的故障 | 請聯絡測試平台的維修廠商。 |