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世基1639、1075、0430檢測套組技術操作上會遇到哪些問題?

世基1639、1075、0430檢測套組

常見問題

以下是在使用世基1639、1075、0430檢測套組的客戶曾經產生的疑問。倘若您無法在此找到解答,煩請與世基生物醫學技術支援部門聯繫,以取得相關資訊或解答您的疑問。

  1. 我應該如何保存這些檢測套組?
    應保存於-20°C。當使用時,應置於冰上解凍,並避免光線直射。
  2. 我能使用含有Heparin的採血管嗎?
    因為Heparin會抑制PCR反應。我們建議您使用含有Sodium Citrate或EDTA為抗凝劑的採血管。
  3. 在萃取基因體DNA時,是否有建議使用的萃取套組?
    我們建議您使用已通過世基公司品質檢測之Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中的基因體DNA。
  4. 通常自DNA萃取套組中所萃取出的基因體DNA濃度為何?
    不同套組會有不同的萃取量,我們建議在DNA萃取後應以分光光度計量測濃度及品質。
  5. DNA的品質要求為何?
    為了維持良好的反應結果,我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
  6. 我應該加入多少基因體DNA?
    我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體 DNA。不足或過量的DNA可能會影響結果數據。
  7. 每個樣本在每一套組中需要多少反應數?
    每個樣本只需一個反應數。每次上機測試皆需伴隨四個控制組(三個陽性控制組,一個為不含核酸的空白控制組,其用來建立分群落點)。
  8. 這些檢測套組中各含有哪些螢光染劑?
    每一套組主要含有螢光物質FAM和VIC。
  9. 主要偵測的應用方法為何?
    此分析方法為一種鑑定SNP方式。利用PCR擴增原理和含有兩種不同螢光的專一性探針來鑑別對偶基因上單一的位點型別(SNP)。
  10. 分析結果如何呈現呢?
    藉由軟體中Allelic Discrimination/Endpoint的分析功能(每個檢體之Endpoint螢光數值扣除初始的背景(Background)螢光數值後產生之訊號差異來判定),和四個控制組的分群定位來區分每個檢體之基因型別。
  11. 我要如何區分檢體的型別呢?
    請依檢體的基因位點坐落於哪一陽性控制組群落來判定該檢體為何基因型別。請參考仿單描述。
  12. 我能只使用Post Read的功能嗎?
    為了降低不必要的螢光訊號干擾,如果您的機器有此功能,請執行Pre Read步驟。請參考仿單描述。
  13. 陽性控制組一定會有訊號嗎?
    陽性控制組為已知之基因型別。套組在正常操作及保存狀況下,陽性控制組一定有訊號,四個控制組會清楚的區分出四個分群落。
  14. 檢體一定會有訊號嗎?
    每個檢體至少帶有一種基因型別,因此,套組在正常的操作、保存狀態下,每個檢體應有屬於自己的群落。假如檢體內含有PCR抑制物,其分群落點會向原點(NTC)以線性靠近,不會有往旁邊偏移而造成判斷上的干擾。
  15. 實驗樣本是否需要重覆檢測(Duplicate)呢?
    依照仿單說明操作,樣本不需重覆檢測。但仍需依照各實驗室的?部品質控管要求調整。
  16. 空白控制組會有明顯的螢光數值嗎?
    空白控制組雖是以不含核酸酶的水取代基因體DNA,仍會有很微弱螢光背景產生,但不影響陽性控制組的分群。當空白控制組出現較高螢光數值時而影響陽性控制組定位時,表示人為污染出現在本次操作中。通常有可能是來自檢體的基因體DNA污染,或是來自陽性控制組的核酸分子的污染。
  17. 我要如何設定即時定量PCR的操作軟體呢?
    世基生物醫學股有限公司提供幾種常用的即時定量PCR操作的說明書,請來信詢問或索取
  18. 我要如何洽詢世基公司的技術支援部門呢?
    請來電02-27985885詢問或寄信至service@pharmigene.com

疑難排解

此疑難排解可能有助於解決您使用世基1639、1075、0430檢測套組時在技術操作或數據分析方面的疑難。倘若您無法在此找到排除疑難的方法,煩請與世基生物醫學技術支援部門聯繫,以取得技術 上的幫助。

問題 可能的原因 建議
a. 沒有偵測到放大訊號 選錯了偵測波段(非SYBR/FAM) 假使您使用的即時偵測定量系統會自動偵測全波段,你只需重新將偵測波段設定至(SYBR/FAM)並重新再計算即可。假使您的系統不能自動偵測全波段,必需重新執行此檢測。
缺少了某必要的成份 -請確認您添加的反應成份。
-請重新執行檢測一次。
-建議每次檢測皆加入套組提供的陽性、空白控制組。
執行程式設定有誤 請確認反應條件是否和仿單上的一致。
機器功能上的故障 請聯絡測試平台的維修廠商。
b. 檢體螢光訊號偏弱 使用含有Heparin為抗凝劑的採血管 請使用含有sodium citrate或EDTA為抗凝劑的採血管。
PCR過程中有抑制反應發生 -進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中的基因體DNA。
加入不適當的基因體DNA總量 我們建議每一反應加入總量為25-100ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成螢光訊號不穩定的風險。
基因體DNA品質不良 -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
-進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。
過低的原濃度基因體DNA 依據不同的萃取方法、血液的品質、保存的條件而有所影響,建議重新基因體DNA萃取以增加濃度。
套組冷、解凍超過三次以上 建議可以先進行少量分裝,以減少冷、解凍的次數。
套組保存在不適的溫度 -請置於-20度長期保存。
-使用時請將試劑置於冰上解凍。
在過度光照下操作過久 -儘可能將操作時間縮短。
-將配置的反應液避光處理。
c. 空白控制組出現過高螢光數據 有污染發生 -重新進行反應一次。
-請全程帶手套配置反應液。
d. 檢體的螢光數值明顯低於陽性控制組 檢體DNA品質不良 -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
-進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應
-建議以Qiagen QIAamp® DNA blood Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。
取量不勻或少加了某成份 請確認可能少加了那些反應成份。
e. 螢光數值有不穩的現象 取量不勻或少加了某成份 請確認可能少加了那些反應成份。
加入不適當的基因體DNA總量 我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成螢光訊號不穩定的風險。
基因體DNA品質不良 -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
-進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。
過低的原濃度基因體DNA 依據不同的萃取方法、血液的品質、保存的條件而有所影響,建議重新基因體DNA萃取以增加濃度。
試劑沒有混合均勻 配置混合液前請均勻混合試劑。
有污染發生 -重新進行反應一次。
-請全程帶手套配置緩衝液。
混合液沒有在管底 請使用較高的離心速度將反應混合液離心到管底
機器功能上的故障 請聯絡測試平台的維修廠商。