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世基5801電泳檢測套組技術操作上會遇到哪些問題?

世基5801電泳檢測套組

常見問題

以下是在使用世基5801電泳檢測套組的客戶曾經產生的疑問。倘若您無法在此找到解答,煩請與世基生物醫學技術支援部門聯繫,以取得相關資訊或解答您的疑問。

  1. 我應該如何保存世基5801電泳檢測套組?
    世基5801電泳檢測套組應保存於-20°C。當使用時,應置於冰上解凍,並避免光線直射。
  2. 我能使用含有Heparin的採血管嗎?
    因為Heparin會抑制PCR反應。我們建議您使用含有Sodium Citrate或EDTA為抗凝劑的採血管。
  3. 在萃取基因體DNA時,是否有建議使用的萃取套組?
    我們建議您使用已通過世基公司檢測品質檢測之Qiagen QIAamp DNA Mini Kit來萃取血液中的基因體DNA。
  4. 通常自DNA萃取套組中所萃取出的基因體DNA濃度為何?
    不同品牌套組會有不同的萃取量,我們建議在DNA萃取後應以分光光度計量測濃度及品質。
  5. DNA的品質要求為何?
    為了維持良好的反應結果,我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
  6. 我應該加入多少基因體DNA?
    我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的不穩定現象。
  7. 每個樣本需要多少反應數?
    每一樣本只需同時上一個反應。同一反應裏包含有PG5801偵測反應和內部控制組偵測反應。
  8. PCR反應擴增循環中只需要二步驟(Denaturation and Extension)?
    我們將Annealing(黏著)和Extension(延展)步驟整合一起以減少反應時間。
  9. 為何PCR反應需要這麼高的黏著(Annealing)溫度?
    在此溫度下才能將HLA-B*5801基因和其它HLA-B*基因型別(超過1800種)做有效的區分。
  10. 該套組對機器溫控精準度的要求如何?
    為了保持最佳的測試條件,此套組的最佳容許溫度約為正負0.5度。PCR機器在正常的保養維護下,絕大部份都能達穩定控溫的要求。
  11. 我的機器是否能達到你們溫控的要求?
    不同的PCR製造廠商對不同的PCR機器控溫的設計都略有差異。對此,我們設計了一套檢體測試組可以協助您將機器調整到最佳的執行條件,請洽公司業務部門。
  12. 我要如何區分檢體是否為陽性或陰性?
    每一樣本皆會出現內部控制組的訊號。如果樣本只出現內部控制組的訊號時(250bp),即為陰性檢體。而如果同時出現內部控制和HLA-B*5801陽性訊號(360bp)者,即為陽性檢體。請參照仿單上的圖示說明。
  13. 內部控制組一定會有訊號嗎?
    內部控制組主要為偵測人類Housekeeping Gene的產物。因此,每一個檢體的內部控制組都會有訊號產生。同時,也藉由其來監測加入檢體的量及品質。
  14. 實驗樣本是否需要重覆檢測(Duplicate)呢?
    依照仿單說明操作,樣本不需重覆檢測。但仍需依照各實驗室的內部品質控管要求調整。
  15. 為什麼有時候空白控制組會微弱的訊號出現?
    空白控制組是以不含核酸酶的水取代基因體DNA。當空白控制組出現訊號時,表示人為污染出現在本次操作中。通常有可能是來自檢體的基因體DNA污染,或是來自陽性控制組的核酸分子的污染。
  16. 我要如何洽詢世基公司的技術支援部門呢?
    請來電02-27985885詢問或寄信至service@pharmigene.com

疑難排解

此疑難排解可能有助於解決您使用世基5801電泳檢測套組時在技術操作或數據分析方面的疑難。倘若您無法在此找到排除疑難的方法,煩請世基生物醫學技術支援部門聯繫,以取得技術 上的幫助。

問題 可能的原因 建議
a. 沒有訊號產生 缺少了某必要的成份 -請確認您添加的反應成份。
-確認後重新執行檢測一次。
-建議每次檢測皆加入套組提供的陽性、空白控制組。
選錯了PCR反應條件 -確認後重新執行檢測一次。
-建議每次檢測皆加入套組提供的陽性、空白控制組。
PCR反應條件設定上有誤 請確認反應條件是否和仿單上的一致。
機器功能上的故障 請聯絡測試平台的維修廠商。
b. 內部控制組的訊號過於微弱 使用含有Heparin為抗凝劑的採血管 -請使用含有sodium citrate或EDTA為抗凝劑的採血管。
-請在三天內完成基因體DNA萃取。
PCR過程中有抑制反應發生 -進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit來萃取血液中的基因體DNA。
加入不適當的基因體DNA總量 我們建議每一反應加入總量為25-100ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的訊號不穩定的風險。
基因體DNA品質不良 -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
-進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。
過低的原濃度基因體DNA 依據不同的萃取方法、血液的品質、保存的條件而有所影響,建議重新基因體DNA萃取以增加濃度並減少回溶的體積。
套組冷、解凍超過三次以上 建議可以先進行分裝,以減少冷、解凍的次數。
套組保存在不適的溫度 -請置於-20度長期保存。
-使用時請將試劑置於冰上解凍。
在室溫下操作過久 -儘可能將操作時間縮短並置於冰上持續保持低溫。
c. 空白控制組出現訊號 有污染發生 -重新進行反應一次。
-請全程帶手套配置PCR反應。
d. 訊號明顯暗於陽性控制組 檢體DNA品質不良 -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
-進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。
取量不勻或少加了某成份 請確認可能少加了那些反應成份。
e. 訊號有不穩定的現象 取量不勻或少加了某成份 請確認可能少加了那些反應成份。
加入不適當的基因體DNA總量 我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的訊號不穩定的風險。
基因體DNA品質不良 -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
-進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。
過低的原濃度基因體DNA 依據不同的萃取方法、血液的品質、保存的條件而有所影響,建議重新基因體DNA萃取以增加濃度並減少回溶的體積。
試劑沒有混合均勻 配置反應液前請均勻混合試劑。
有污染發生 -重新進行反應一次。
-請全程帶手套配置PCR反應。
加入不適當的基因體DNA總量 我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的訊號不穩定的風險。
反應液沒有在管底 請使用較高的離心速度將反應緩衝液離心到管底。
機器功能上的故障 請聯絡測試平台的維修廠商。