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世基5801檢測套組技術操作上會遇到哪些問題?

世基5801檢測套組

常見問題

以下是在使用世基5801檢測套組的客戶曾經產生的疑問。倘若您無法在此找到解答,煩請與世基生物醫學技術支援部門聯繫,以取得相關資訊或解答您的疑問。

  1. 我應該如何保存世基5801檢測套組?
    世基5801檢測套組應保存於-20°C。當使用時,應置於冰上解凍,並避免光線直射。
  2. 我能使用含有Heparin的採血管嗎?
    因為Heparin會抑制PCR反應。我們建議您使用含有Sodium Citrate或EDTA為抗凝劑的採血管。
  3. 在萃取基因體DNA時,是否有建議使用的萃取套組?
    我們建議您使用已通過世基公司檢測品質檢測之Qiagen QIAamp DNA Blood Mini Kit來萃取血液中的基因體DNA。
  4. 通常自DNA萃取套組中所萃取出的基因體DNA濃度為何?
    不同品牌套組會有不同的萃取量,我們建議在DNA萃取後應以分光光度計量測濃度及品質。
  5. DNA的品質要求為何?
    為了維持良好的反應結果,我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
  6. 我應該加入多少基因體DNA?
    我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的Ct值過高的風險。
  7. 每個樣本需要多少反應數?
    每一樣本需同時上兩個反應。一個是PG5801偵測反應,另一則是內部控制組偵測反應。
  8. 5801檢測套組中含有哪些螢光染劑?
    主要含有螢光物質SYBR Green I。你可以在機器上選擇SYBR or FAM的螢光偵測(為相同的波長)。
  9. 在即時聚合酶連鎖反應的軟體設定上,我應該如何設定Quencher或Reference dye?
    Quencher應被設定為無(None)。如果您使用的設備有需要設定Reference dye,請選擇Rox.。
  10. 我要如何設定機器分析的閥值呢?
    依不同廠牌不同機型有不同的設定。請參考仿單上第4.4節的建議閥值設定。
  11. 我要如何區分檢體是否為陽性或陰性?
    當內部控制組IC Ct ≤27且∆Ct ≤7時,即為陽性檢體。當IC Ct ≤27且∆Ct >7時,即為陰性檢體。
  12. 我是否需要對兩種不同的偵測組分別設定兩個不同的閥值呢?
    只需要設定一組閥值即可,請參考仿單上第4.4節的建議的閥值設定。我們考量到使用上的方便性,特別設計了兩種相同斜率的擴增曲線,因此只需要設定一組閥值即可。
  13. 內部控制組一定會有訊號嗎?
    內部控制組主要為偵測人類Housekeeping Gene的產物。因此,每一個檢體的內部控制組都會有訊號產生。同時,也藉由其來監測加入檢體的量及品質。
  14. PG5801偵測反應是否一定會有數值產生呢?
    每一個檢體應有內部控制組的Ct值數據。至於PG5801偵測組Ct值數據則是在偵測到HLA-B*5801基因序列或相似序列的檢體時才會產生。
  15. 實驗樣本是否需要重覆檢測(Duplicate)呢?
    依照仿單說明操作,樣本不需重覆檢測。但仍需依照各實驗室的內部品質控管要求調整。
  16. 為什麼有時候空白控制組會有Ct數值出現?
    空白控制組是以不含核酸酶的水取代基因體DNA。當空白控制組出現Ct值時,表示人為污染出現在本次操作中,通常有可能是來自檢體的基因體DNA污染,或是來自陽性控制組的核酸分子的污染。
  17. 我要如何設定即時定量PCR的操作軟體呢?
    世基生物醫學股有限公司提供幾種常用的即時定量PCR操作的說明書,請來信詢問或索取。
  18. 我要如何洽詢世基公司的技術支援部門呢?
    請來電02-27985885詢問或寄信至service@pharmigene.com

疑難排解

此疑難排解可能有助於解決您使用世基5801檢測套組時在技術操作或數據分析方面的疑難。倘若您無法在此找到排除疑難的方法,煩請與世基生物醫學技術支援部門聯繫,以取得技術 上的幫助。

問題 可能的原因 建議
a. 沒有偵測到放大訊號 選錯了偵測波段(非SYBR/FAM) 假使您使用的即時偵測定量系統會自動偵測全波段,你只需重新將偵測波段設定至(SYBR/FAM)並重新再計算即可。假使您的系統不能自動偵測全波段,必需重新執行此檢測。
缺少了某必要的成份 -請確認您添加的反應成份。
-請重新執行檢測一次。
-建議每次檢測皆加入套組提供的陽性、空白控制組。
執行程式設定有誤 請確認反應條件是否和仿單上的一致。
機器功能上的故障 請聯絡測試平台的維修廠商。
b. 內部控制組的Ct值過高(IC>27) 使用含有Heparin為抗凝劑的採血管 -請使用含有sodium citrate或EDTA為抗凝劑的採血管。
-請在三天內完成基因體DNA萃取。
PCR過程中有抑制反應發生 -進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中的基因體DNA。
加入不適當的基因體DNA總量 我們建議每一反應加入總量為25-100ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的Ct值過高的風險。
基因體DNA品質不良 -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
-進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。
過低的原濃度基因體DNA 依據不同的萃取方法、血液的品質、保存的條件而有所影響,建議重新基因體DNA萃取以增加濃度並減少回溶的體積。
套組冷、解凍超過三次以上 建議可以先進行分裝,以減少冷、解凍的次數。
套組保存在不適的溫度 -請置於-20度長期保存。
-使用時請將試劑置於冰上解凍。
在過度光照下操作過久 -儘可能將操作時間縮短。
-將配置的反應液避光處理。
c. 陰性控制組出現Ct數據 有污染發生 -重新進行反應一次。
-請全程帶手套配置反應液。
d. 檢體的∆Ct明顯高於陽性控制組的 檢體DNA品質不良 -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
-進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。
取量不勻或少加了某成份 請確認可能少加了那些反應成份。
e. Ct值有不穩的現象 取量不勻或少加了某成份 請確認可能少加了那些反應成份。
加入不適當的基因體DNA總量 我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的Ct值過高的風險。
基因體DNA品質不良 -我們建議DNA的OD260/280比例為1.7到2.0之間。
-進行基因體DNA純化的程序以降低抑制反應。
-建議以Qiagen QIAamp® DNA Blood Mini Kit來萃取血液中基因體DNA。
過低的原濃度基因體DNA 依據不同的萃取方法、血液的品質、保存的條件而有所影響,建議重新基因體DNA萃取以增加濃度。
試劑沒有混合均勻 配置反應液前請均勻混合試劑。
有污染發生 -重新進行反應一次。
-請全程帶手套配置反應液。
加入不適當的基因體DNA總量 我們建議每一反應加入總量為25-100 ng之基因體DNA。不足或過量的DNA可能會造成內部控制組的Ct值過高的風險。
反應液沒有在管底 請使用較高的離心速度將反應緩衝液離心到管底。
機器功能上的故障 請聯絡測試平台的維修廠商。